Способ количественной оценки вирусной нагрузки в клинических образцах

Кашников Александр Юрьевич

При исследовании кишечных вирусов часто возникает необходимость абсолютной количественной оценки вирусной нагрузки (ВН). Определение количества единиц вируса в пробе возможно только с использованием методов, в основе которых лежит применение стандартов, идентичных исследуемому образцу. Не самым точным, но эффективным методом количественного анализа ВН является трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Этот метод основан на использовании живой вирусной культуры (ЖВК) ‒ наиболее адекватного из существующих международных стандартов для количественного определения ВН. В последние годы в количественном анализе ВН предпочтение отдается абсолютному варианту ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Однако, данный метод не менее трудоемок, чем ТЭМ и относительный вариант ПЦР в реальном времени. В данной работе предлагается упрощенный способ количественной оценки ВН в клинических образцах. Суть его сводится к количественному определению ВН по стандартному графику, построенному по данным, полученным с использованием наиболее простой в исполнении техники NanoDrop-спектрофотометрии. Данный способ позволяет определить ВН в предварительно очищенном и сконцентрированном вирусосодержащем образце по концентрации выделенной нуклеиновой кислоты (НК), которая примерно сопоставима количественно с содержанием вируса в пробе. В предлагаемом способе используется информация о вирусах, присутствующих в клиническом образце, полученная относительным вариантом ПЦР. Стандартом для построения калибровочного графика служит одна из клинических проб с высокой концентрацией вирусных частиц. Достоверность информации о величине ВН, вычисленной предлагаемым методом, подтверждена количественными данными, полученными с помощью ТЭМ. Графический метод позволит определять ВН в клинических образцах с одним или несколькими видами вирусов, отдельно для каждого вида. Он существенно упростит количественный анализ ВН в образцах с возможностью определения числа вирусных частиц только на основе данных о концентрации вирусного генетического материала, полученных методом NanoDrop-спектрофотометрии. С помощью графического способа можно будет определять количество вируса в пробах от 108 частиц/мл и выше, а при предварительном концентрировании ‒ и с меньшей концентрацией.

Ключевые слова:вирусная нагрузка, нуклеиновая кислота, ПЦР в реальном времени, NanoDrop-спектрофотометрия, градуировочная кривая, трансмиссионная электронная микроскопия, латексные частицы.